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Le joueur se retrouve une nouvelle fois dans le rôle du pilote du vaisseau Vic Viper pour affronter l'empire bactérion, nouvellement dirigé par Gofer. Gradius II possède un gameplay similaire au jeu original, mais incorporant des améliorations tirés du spin-off Salamander comme les deux configurations d'armes sélectionnables. C'est aussi le premier jeu de la série à intégrer le "boss rush", un niveau comprenant uniquement les confrontations contre les boss.
